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Artigo Original

Estabelecimento de protocolo de glicerolização de membranas amnióticas para uso como curativo biológico

Establishment of amniotic membranes glycerolization protocol for use as biological dressing

André Oliveira Paggiaro1; Mônica Beatriz Mathor2; Viviane Fernandes de Carvalho3; Eugenio Pólo4; Marisa Roma Herson5; Marcus Castro Ferreira6

RESUMO

Introduçao: Pesquisadores têm procurado explorar várias alternativas terapêuticas, biológicas ou sintéticas, capazes de assegurar condiçoes ideais ao leito da ferida, que favoreçam o processo de cicatrizaçao. Uma opçao menos onerosa é o uso de membranas amnióticas. Os curativos constituídos de âmnion formam uma barreira protetora contra as bactérias ambientais, aceleram a reepitelizaçao das lesoes e diminuem a dor local. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolo de processamento de membranas amnióticas em altas concentraçoes de glicerol. Método: Foram obtidas 3 amostras de membranas amnióticas, que preenchiam os critérios de inclusao e que as gestantes concordaram em ceder o material para pesquisa. Resultados: Os exames de cultura do material no momento da captaçao mostravam ausência de crescimento bacteriano ou de fungos. As sorologias das pacientes eram todas negativas. Conclusao: Nesse trabalho, buscamos estabelecer um protocolo de conservaçao de membranas amnióticas baseado na glicerolizaçao, pois se trata de um método de baixo custo, relativamente simples e de fácil estocagem do material. Apresenta como desvantagem a sua alta toxicidade celular, resultando em destruiçao das células do tecido, porém preserva a integridade estrutural tecidual, conforme demonstrado em nossos resultados macroscópicos e microscópicos.

Palavras-chave: Queimaduras. Curativos biológicos. Projetos de pesquisa.

ABSTRACT

Background: Researchers have attempted to explore various alternative therapies, biological or synthetic, capable of providing ideal conditions to the wound bed to promote the healing process. An option less costly is the use of amniotic membranes. Dressings consist of amnion forms a protective barrier against environmental bacteria, accelerate reepithelialization of lesions and reduce local pain. Objective: The aim of this study was to establish protocol processing of membranes in high concentrations of glycerol. Methods: Three samples were obtained from amniotic membranes who met the inclusion criteria and that the pregnant agreed to donate the material for research. Results: The examinations of material culture at the time of capture showed no bacterial or fungal growth. The serology of the patients was all negative. Conclusion: In this paper, we established a protocol for the conservation of membranes based on glycerol because it is a low-cost, relatively simple and easy storage of the material. Presents the disadvantage of its high cell toxicity, resulting in destruction of tissue cells, but preserves the structural integrity of tissue as shown in our results the microscopic and macroscopic.

Keywords: Burns. Biological dressings. Research design.

O objetivo primário do tratamento do grande queimado é eliminar o tecido desvitalizado e cobrir prontamente a ferida, buscando evitar complicaçoes sépticas, metabólicas e funcionais que uma lesao colonizada e aberta pode acarretar1. Em áreas de queimaduras de 2º grau superficial ou profundo, procuramos ainda proporcionar condiçoes locais ideais para a ocorrência eficiente dos fenômenos da cicatrizaçao e de reepitelizaçao espontânea no menor prazo de tempo. Evitando, assim, contaminaçoes bacterianas excessivas ou depósitos exagerados de matriz extracelular, que podem resultar em sequelas funcionais e estéticas tardias2.

Na medida em que se consolidam os conceitos de microambiente da ferida e da sua interaçao com os materiais de curativo, os pesquisadores têm procurado explorar várias alternativas terapêuticas biológicas ou sintéticas, capazes de assegurar condiçoes ideais ao leito da ferida, que favoreçam aos processos de cicatrizaçao e reepitelizaçao. No entanto, apesar da grande variedade de materiais disponíveis no mercado, a maior parte deles nao está disponível em nosso país, exigindo sua importaçao com elevado custo para o sistema de saúde pública3.

Uma opçao menos onerosa é o uso de membranas amnióticas. Os curativos constituídos de âmnion formam uma barreira protetora contra as bactérias ambientais, aceleram a reepitelizaçao das lesoes e diminuem a dor local por proteger as terminaçoes nervosas e reduzir a inflamaçao local3-6. O uso de membranas amnióticas frescas ou processadas para curativo biológico tem sido consagrado na literatura internacional pelos inúmeros trabalhos publicados nas últimas décadas.

Rejzek et al.7 utilizaram a membrana em 50 pacientes, em sua maioria com queimaduras de segundo grau, sendo que os curativos eram removidos em quinze dias, nao necessitando de outros cuidados; neste estudo, os autores relataram menor formaçao de cicatrizes em relaçao ao tratamento com curativos convencionais. Ravishanker et al.8 observaram restauraçao em feridas superficiais em todos os 61 casos estudados, ocorridos entre 7 a 10 dias.

O desenvolvimento de técnicas para o processamento de membranas amnióticas em território nacional poderia consolidar mais uma opçao de tratamento ao paciente queimado. Entre os possíveis métodos de preservaçao de material biológico, o uso do glicerol em altas concentraçoes (> 85%) pode ser considerado como bastante atrativo aos bancos de tecido, pois apresenta custo reduzido, torna os materiais biológicos menos antigênicos ao tornar as células nao viáveis, apresenta efeito antibacteriano e antiviral e permite a conservaçao dos tecidos por até 5 anos a -4ºC.

O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolo de processamento de membranas amnióticas em altas concentraçoes de glicerol (>85%) no Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo (BT-ICHCFMUSP), com o uso de esterilizaçao terminal (irradiaçao) quando necessário, assegurando sua qualidade para uso clínico.


MÉTODO

O projeto teve aprovaçao pela Comissao de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Universidade de Sao Paulo.

Origem das membranas

As membranas foram provenientes de doaçoes voluntárias de três gestantes jovens (20-35 anos) com gestaçoes sem intercorrências, pós partos cesárea com produtos normais, sem antecedentes médico-sociais que precluam esta doaçao e confirmadas como sorologicamente negativas, após duas baterias de exames, para contato com HIV, hepatite B e C, HTLV e doença de Chagas.

Método de preparo das membranas

Após coleta estéril e separaçao do córion, as membranas amnióticas foram transportadas ao Banco de Tecido (BT-ICHCFMUSP). A partir deste momento, todo o manuseio ocorreu dentro da proteçao do fluxo laminar. Após sua higiene e coleta de amostras para provas microbiológicas, foram colocadas em soluçao salina com antibióticos (penicilina cristalina - 1.000.000 U/L e sulfato de estreptomicina - 1g/L) entre 6 a 12 horas a 4ºC. Em seguida, após a remoçao de resíduos remanescentes, as membranas foram expostas a uma soluçao de glicerol >85% com antibióticos e sob movimentaçao a 37ºC durante duas horas. Transcorrido este intervalo de tempo, as membranas foram colocadas em soluçao fresca de glicerol >85%, abertas, apostas a papel de filtro e recortadas no formato desejado. Após amostragem do material para análise microbiológica (bactérias aeróbicas / anaeróbicas Gram +, Gram - e fungos), as membranas foram embaladas em material validado para esta finalidade e conservadas em 4ºC. Metade de cada uma destas membranas foi enviada ao IPEN (Instituto de Pesquisa Energéticas e Nucleares) e submetida à esterilizaçao terminal por irradiaçao à 25 kGy por 2 diferentes metodologias: aceleraçao de elétrons e radiaçao gama do cobalto 60. Depois disto, as membranas foram re-hidratadas em soro fisiológico por 30 minutos, para observar se retomavam suas características biomecânicas iniciais.

Análise macroscópica e histológica das membranas

As membranas amnióticas foram divididas em 3 grupos:

  • gliceroladas e nao irradiadas;
  • gliceroladas e irradiadas à 25 kGy em acelerador de elétrons;
  • gliceroladas e irradiadas à 25 kGy em cobalto 60.


  • Amostras de membranas dos 3 grupos foram re-hidratadas e avaliadas macroscopicamente quanto a suas características físicas após os diferentes tipos de processamento a que foram submetidas. Foram também enviadas amostras para inclusao em parafina, cortes e coloraçao com hematoxilina-eosina (HE) para análise em microscopia óptica.


    RESULTADOS

    Obtençao das membranas


    Foram obtidas 3 amostras de membranas amnióticas, que preenchiam os critérios de inclusao e que a gestantes concordaram em ceder o material para pesquisa. Os exames de cultura do material no momento da captaçao demonstravam ausência de crescimento bacteriano ou de fungos. As sorologias das pacientes eram todas negativas.

    Processamento das membranas amnióticas (glicerolizaçao)

    As três membranas amnióticas foram submetidas com sucesso ao processo de glicerolizaçao, sendo estocadas a 4ºC até que todos os resultados de cultura e sorologia se confirmassem negativos. Depois disto, foram divididas em 3 grupos, sendo que 2 deles foram enviados ao IPEN para irradiaçao em acelerador e o outro em cobalto 60.

    Análise macroscópica e histológica das membranas

    Em todos os três grupos, quando ainda conservadas em glicerol, as membranas amnióticas possuíam aspecto inelástico e brilhante (Figura 1). Uma vez removido o glicerol pela exposiçao em soluçao salina por 30 minutos, ocorreu o retorno da opacidade e da maior elasticidade do tecido (Figura 2) nos três grupos.


    Figura 1 - Amnion glicerolado.


    Figura 2 - Amnion após re-hidrataçao.



    Apesar do retorno da opacidade e da elasticidade nos três grupos, isto nao ocorreu igualmente entre eles. Verificamos que as membranas nao irradiadas preservam muito mais as características mecânicas do tecido, sendo mais resistentes à traçao, mais fáceis de serem manipuladas e esticadas e com coloraçao mais semelhante ao tecido fresco. Enquanto isso, as amostras irradiadas tanto por acelerador como cobalto 60 geram membranas com alteraçoes significativas de sua resistência mecânica, pois acabam por romper com mais facilidade. Além disso, apresentam coloraçao mais acastanhada e sao extremamente difíceis de serem manipuladas e esticadas.

    Pode-se ainda perceber que um dos lados da membrana é mais brilhante que o outro. O lado de maior brilho é aquele em que se encontra o epitélio do tecido, isto deve ser informado ao usuário no momento do transplante para que o tecido seja posicionado corretamente sobre a ferida, ou seja, com o epitélio voltado para cima.

    Análise histológica

    Na análise histológica, podemos perceber que a membrana sem irradiaçao apresenta células epiteliais mais intactas com estrutura preservada e as lâminas conjuntivas sem vacuolizaçao e com pouca delaminaçao (Figura 3A). Em contrapartida, as membranas irradiadas apresentam células epiteliais mais deterioradas, com pequenas extensoes de membrana se soltando em áreas apicais e tecido conjuntivo com delaminaçoes mais perceptíveis (Figuras 3B e C).


    Figura 3 - A: sem irradiaçao; B: acelerador; C: cobalto 60.



    DISCUSSAO

    A membrana amniótica é histologicamente muito similar à pele, uma vez que é originada do ectoderma embrionário, sendo um análogo à pele do embriao9. Assim, apresenta muitas das características da pele humana, podendo funcionar como barreira contra a invasao bacteriana, reduzir a perda de fluidos corpóreos e proteínas, aportar fatores de crescimento e moduladores da cicatrizaçao; enfim restabelecer as condiçoes ideais para que os processos de cicatrizaçao progridam satisfatoriamente3.

    A invasao bacteriana é um obstáculo importante para o processo de restauraçao, ao aumentar o processo inflamatório local10. Os curativos de membrana amniótica formam uma barreira protetora contra as bactérias ambientais. O efeito antimicrobiano parece ocorrer devido ao contato íntimo da membrana com a ferida, promovendo uma inibiçao bacteriana por contato11; ou ainda, a restauraçao da microcirculaçao local permitiria um "turn-over" acentuado de fagócitos e de fatores bacteriostáticos séricos5.

    Um efeito importante e frequentemente relatado com o uso de membranas amnióticas é sua capacidade em acelerar a reepitelizaçao das feridas12. As células do âmnio produzem e liberam diversos fatores de crescimento: fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento transformador, fator de crescimento semelhante à insulina, fator de crescimento do hepatócito, fator de crescimento neural e fator de crescimento vascular endotelial. Todos estes fatores foram apontados como a causa da influência positiva da membrana amniótica sobre a proliferaçao epitelial9, mesmo que as células do âmnion sejam destruídas em vários protocolos de conservaçao8.

    Ao proteger as terminaçoes nervosas, prevenir a invasao bacteriana, diminuir a inflamaçao local, manter a hidrataçao local ideal e, principalmente, reduzir o número de trocas do curativo, o âmnio é capaz de promover uma ferida menos dolorosa1,4. Sendo que a incidência de queimaduras na infância é alta, este pode ser um argumento importante para sua eleiçao como curativos em crianças. Ravishanker et al.8 relataram que as crianças se acalmavam logo após a aplicaçao da membrana e os adultos afirmavam que o alívio era muito significante comparado com os curativos convencionais onde 80% de seus pacientes queixavam-se de dor e desconforto.

    Apesar destas vantagens, sua principal desvantagem reside no fato de ser um material biológico, de origem humana. Consequentemente, pode ser um veículo potencial de doenças infecto-contagiosas. Para reduzir ao grau mínimo o risco de transmissao de doenças infecto-contagiosas através das membranas, é rotineiramente realizada a triagem das doadoras seguindo-se protocolos internacionalmente reconhecidos. Estes protocolos incluem a investigaçao de fatores de risco, determinados por meio do histórico médico-social e da realizaçao de testes sorológicos que afastem o risco de HIV, hepatites B e C, HTLV, sífilis e, em nosso meio, doença de Chagas. Os exames sorológicos para a detecçao de HIV e hepatite B e C sao repetidos novamente transcorridos seis meses da doaçao, com o intuito de eliminar janelas de risco biológico. Ainda, sao aceitas membranas fetais apenas de partos cesárea, de parturientes sem histórico de doenças ginecológicas (ex: endometrite ou doença inflamatória pélvica, endometriose, etc), alteraçoes patológicas na gestaçao (ex: ruptura prematura da bolsa, toxemia, sinais de sofrimento fetal, mecônio, etc) ou suspeita e sinais de mal-formaçao congênita do concepto. As membranas sao testadas ainda quanto a possíveis contaminaçoes bacterianas e fúngicas, sendo que faz parte dos protocolos de conservaçao a adiçao de medidas bactericidas e bacteriostáticas, tais como banhos em agentes anti-sépticos.

    Sabe-se que alguns tipos de processamento dos tecidos podem gerar exposiçao a agentes virucidas e bactericidas, reduzindo o risco de transmissao de agentes infecciosos. Em seu estudo, van Baare et al.13 observaram que a conservaçao de pele em glicerol 70 ou 85% é capaz de inativar o HIV-1 intra e extracelular.

    A glicerolizaçao foi descrita pela primeira vez por Basile, em 1982, para preservaçao de pele de porco. O glicerol desidrata a pele, removendo o fluido intracelular. Porém, ele nao altera a concentraçao de íons das células, desta forma mantendo a integridade estrutural do tecido e servindo como um método de preservaçao. Após re-hidrataçao em soro fisiológico, o tecido recupera sua pliabilidade7.

    Nesse trabalho, buscamos estabelecer um protocolo de conservaçao de membranas amnióticas baseado na glicerolizaçao, pois se trata de um método de baixo custo, relativamente simples e de fácil estocagem do material. Apresenta como desvantagem a sua alta toxicidade celular, resultando em destruiçao das células do tecido, porém preserva a integridade estrutural tecidual, conforme demonstrado em nossos resultados macro e microscópicos.

    Como resultado de sua citotoxidade, o glicerol em altas concentraçoes provoca um efeito benéfico, pois apesar de ser considerado um clássico método de preservaçao, acarreta também a destruiçao de vírus e bactérias, ocasionando um efeito sinérgico esterilizante do material. Gajiwala et al.4 utilizaram como método de preservaçao a exposiçao ao glicerol 85% e armazenamento a 4ºC, relatando a ausência de crescimento bacteriano por mais de um ano.

    Apesar deste efeito "esterilizante", a maior parte dos bancos de tecido do mundo só considera o tecido completamente estéril quando submetido a um processo complementar de esterilizaçao. Atualmente, o mais consagrado na literatura é a radioesterilizaçao, que pode ser realizada por dois mecanismos principais: o acelerador de elétrons e as fontes de cobalto 60. Em nossos estudos, submetemos amostras de âmnions glicerolizadas a estas duas fontes de energia, nao sendo encontradas diferenças significativas entre os dois, tanto macro como microscopicamente. Porém, quando se compara o tecido nao irradiado com o irradiado percebem-se diferenças claras entre os tecidos.

    O material nao irradiado apresenta um epitélio e estruturas do tecido conjuntivo mais intactos quando comparados ao irradiado. Estas alteraçoes estruturais podem gerar resultados clínicos menos favoráveis, entretanto o tecido transplantado oferece muito maior segurança ao indivíduo receptor. Desta forma, o banco de tecidos deve levar em consideraçao todas estas informaçoes para indicar o uso de radioesterilizaçao complementar. Em nosso caso, indicamos só para aqueles materiais comprovadamente contaminados com bactérias gram positivas, que podem ser eliminadas pela irradiaçao. Enquanto isso, para as bactérias gram negativas contraindica-se a radioesterilizaçao pelo risco da liberaçao de fatores pirogênicos.

    O estabelecimento de um protocolo de processamento de membranas amnióticas em um banco de tecidos é fundamental para que este possa fornecer um tecido com rigoroso controle de qualidade, garantindo a menor possibilidade de riscos ao usuário. Em um país como o nosso, com extremas dificuldades financeiras para sustentabilidade da saúde pública, o uso das membranas amnióticas glicerolizadas surge como um promissor método de substituto cutâneo de baixo custo e alta disponibilidade para o tratamento de pacientes queimados.


    REFERENCIAS

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    13. van Baare J, Cameron PU, Vardaxis N, Pagnon J, Reece J, Middelkoop E, et al. The 1998 Lindberg Award. Comparison of glycerol preservation with cryopreservation methods on HIV-1 inactivation. J Burn Care Rehabil. 1998;19(6):494-500.










    1. Médico Assistente da Unidade de Queimaduras da Divisao de Cirurgia Plástica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo (FMUSP).
    2. Doutora em Tecnologia Nuclear Básica pela Universidade de Sao Paulo. Pesquisadora do Instituto de Pesquisas Nucleares - IPEN.
    3. Doutora em Ciências da Saúde pela Disciplina de Cirurgia Plástica da FMUSP.
    4. Enfermeiro do Banco de Tecidos da Divisao de Cirurgia Plástica do Hospital das Clínicas da FMUSP.
    5. Médica, Doutora em Clínica Cirúrgica pela FMUSP.
    6. Médico, Professor Titular da Disciplina de Cirurgia Plástica da FMUSP.

    Correspondência:
    André Oliveira Paggiaro
    Laboratório de Investigaçao Médica (LIM 4) - Faculdade de Medicina USP
    Av. Dr. Arnaldo, 455 - sala 1363
    Sao Paulo, SP - CEP: 01246-903
    E-mail: andrepaggiaro@yahoo.com.br

    Recebido em: 19/1/2010
    Aceito em: 11/3/2010

    Trabalho realizado no Laboratório de Investigaçao Médica (LIM 4) da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, SP.

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